Прегабалін не є агоністом рецепторів GABAA або GABAB.
Прегабалін є габапентиноїдом і діє шляхом інгібування певних кальцієвих каналів.Зокрема, це ліганд допоміжного сайту субодиниці α2δ певних залежних від напруги кальцієвих каналів (VDCC), і, таким чином, діє як інгібітор VDCC, що містять субодиницю α2δ.Існують дві субодиниці α2δ, що зв’язують ліки, α2δ-1 і α2δ-2, і прегабалін проявляє подібну спорідненість (і, отже, відсутність селективності між) цими двома ділянками.Прегабалін є селективним у зв’язуванні з субодиницею α2δ VDCC.Незважаючи на те, що прегабалін є аналогом ГАМК, він не зв’язується з рецепторами ГАМК, не перетворюється в ГАМК або інший агоніст ГАМК-рецепторів in vivo і безпосередньо не модулює транспорт або метаболізм ГАМК.Проте було виявлено, що прегабалін викликає дозозалежне збільшення експресії в мозку L-глутамінової кислоти декарбоксилази (GAD), ферменту, відповідального за синтез ГАМК, і, отже, може мати деякі непрямі ГАМКергічні ефекти, підвищуючи рівні ГАМК в мозку.Наразі немає доказів того, що ефекти прегабаліну опосередковуються будь-яким механізмом, крім інгібування α2δ-містять VDCC.Відповідно, інгібування прегабаліном α2δ-1-вмісних VDCC є відповідальним за його протисудомну, анальгетичну та анксіолітичну дію.
Ендогенні α-амінокислоти L-лейцин та L-ізолейцин, які за хімічною структурою дуже нагадують прегабалін та інші габапентиноїди, є очевидними лігандами субодиниці α2δ VDCC з такою ж спорідненістю, як і габапентиноїди (наприклад, IC50 = 71 nM ізолейцин), і присутні в спинномозковій рідині людини в мікромолярних концентраціях (наприклад, 12,9 мкМ для L-лейцину, 4,8 мкМ для L-ізолейцину).Було припущено, що вони можуть бути ендогенними лігандами субодиниці і що вони можуть конкурувати проти дії габапентиноїдів.Відповідно, хоча габапентиноїди, такі як прегабалін і габапентин, мають наномолярну спорідненість до субодиниці α2δ, їх потенції in vivo знаходяться в низькому мікромолярному діапазоні, і вважається, що конкуренція за зв’язування ендогенними L-амінокислотами, ймовірно, є відповідальною за цю невідповідність.

В одному дослідженні було виявлено, що прегабалін має в 6 разів більшу спорідненість, ніж габапентин, до α2δ-субодиниць VDCC.Однак інше дослідження показало, що прегабалін і габапентин мають подібну спорідненість до рекомбінантної субодиниці α2δ-1 людини (Ki = 32 нМ і 40 нМ відповідно).У будь-якому випадку прегабалін є в 2–4 рази ефективнішим за габапентин як анальгетик, а у тварин — у 3–10 разів ефективніший, ніж габапентин як протисудомний засіб.