Прегабалін не є агоністом ГАМКВ або ГАМКВ рецепторів.
Прегабалін є габапентиноїдом і діє шляхом інгібування певних кальцієвих каналів. Зокрема, він є лігандом допоміжного сайту α2δ субодиниці певних вольтаж-залежних кальцієвих каналів (VDCC), і таким чином діє як інгібітор VDCC, що містить субодиницю α2δ. Існує дві α2δ-субодиниці, що зв’язують ліки, α2δ-1 і α2δ-2, і прегабалін демонструє подібну спорідненість (і, отже, відсутність селективності між) цими двома ділянками. Прегабалін селективно зв’язується з субодиницею α2δ VDCC. Незважаючи на те, що прегабалін є аналогом ГАМК, він не зв’язується з ГАМК-рецепторами, не перетворюється на ГАМК або інший агоніст ГАМК-рецепторів in vivo та безпосередньо не модулює транспорт чи метаболізм ГАМК. Проте було виявлено, що прегабалін викликає дозозалежне збільшення експресії декарбоксилази L-глутамінової кислоти (GAD), ферменту, відповідального за синтез ГАМК, і, отже, може мати деякі непрямі ГАМК-ергічні ефекти шляхом підвищення рівня ГАМК у мозку. Наразі немає доказів того, що ефекти прегабаліну опосередковуються будь-яким іншим механізмом, окрім інгібування VDCC, що містять α2δ. Відповідно, інгібування VDCC, що містять α2δ-1, за допомогою прегабаліну, очевидно, відповідає за його протисудомну, аналгетичну та анксіолітичну дію.
Ендогенні α-амінокислоти L-лейцин та L-ізолейцин, які за хімічною структурою дуже нагадують прегабалін та інші габапентиноїди, є очевидними лігандами субодиниці α2δ VDCC з такою ж спорідненістю, як і габапентиноїди (наприклад, IC50 = 71 нМ для L- ізолейцин) і присутні в спинномозковій рідині людини у мікромолярних концентраціях (наприклад, 12,9 мкМ для L-лейцину, 4,8 мкМ для L-ізолейцину). Було висунуто теорію, що вони можуть бути ендогенними лігандами субодиниці та можуть конкурентно протидіяти ефектам габапентиноїдів. Відповідно, хоча габапентиноїди, такі як прегабалін і габапентин, мають наномолярну спорідненість до субодиниці α2δ, їхня ефективність in vivo знаходиться в низькому мікромолярному діапазоні, і вважається, що конкуренція за зв’язування з боку ендогенних L-амінокислот, ймовірно, є причиною цієї невідповідності.

В одному дослідженні було встановлено, що прегабалін має в 6 разів вищу спорідненість, ніж габапентин, до VDCC, що містять субодиницю α2δ. Однак інше дослідження показало, що прегабалін і габапентин мають подібну спорідненість до рекомбінантної субодиниці α2δ-1 людини (Ki = 32 нМ і 40 нМ відповідно). У будь-якому випадку прегабалін у 2–4 рази сильніший за габапентин як анальгетик, а у тварин — у 3–10 разів сильніший за габапентин як протисудомний засіб.